Teori tentang Kromatografi Eksklusi/Permeasi Gel

 

               Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCO3). Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan untuk bidang kimia analisis. Kromatografi dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, maupun preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang mengunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Gandjar, 2007). Teknik kromatografi sendiri telah dikembangkan dan telah digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang kompleks, baik komponen organik maupun komponen anorganik. Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c) kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e) kromatografi eksklusi ukuran; serta kromatografi afinitas (Gandjar, 2007).

A. KROMATOGRAFI EKSKLUSI

            Size exclusion chromatography (SEC) disebut juga gel permeation chromatography (GPC), gel filtration chromatography (GFC), merupakan metode kromatografi yang menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda. Teknik SEC pertama kali ditemukan oleh Grant Henry Lathe dan Colin R Ruthven.

            SEC umumnya diaplikasikan untuk kompleks makromolekuler sperti protein dan industri polimer terutama digunakan untuk memisahkan molekul biologis, untuk menentukan bobot molekul dan distribusi bobot molekul dari polimer. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat memasuki partikel dan mempunyai jalur dan waktu transit yang lebih panjang dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Semua molekul yang lebih besar dari ukuran pori tidak tertahan dan terelusi bersama. Molekul yang memasuki pori akan mempunyai waktu tinggal dalam partikel yang tergantung pada ukuran dan bentuk molekul. Molekul yang berbeda mempunyai waktu transit yang berbeda untuk melewati kolom.

Mekanisme SEC

 

            Buffer dipompa melewati kolom oleh alat yang diatur oleh komputer. Saat campuran molekul dan ion-ion yang terlarut dalam pelarut diaplikasikan pada ujung atas kolom, molekul-molekul yang lebih kecil (dan ion) didistribusikan melalui volume pelarut yang lebih besar daripada yang tersedia unutk molekul besar. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat masuk ke dalam partikel dan karenanya memiliki jalur yang lebih panjang serta waktu transit yang lebih panjang dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Seluruh molekul yang lebih besar ukurannya dibandingkan ukuran yang tidak tertahan dan akan dielusi bersamaan. Molekul yang dapat masuk ke dalam pori akan memiliki waktu tinggal rata-rata dalam partikel, yang bergantung dari bentuk serta ukuran molekulnya. Karena itu, molekul besar bergerak lebih cepat melewati kolom, dan dengan inilah campuran tersebut dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya.

 

 

Prinsip SEC

 

   Exclusion Chromatography (EC) yang bisa disebut juga Size Exclusion Chromatography (SEC), Gel Permeation Chromatography (GPC), atau Gel Filtration Chromatography (GFC), merupakan metode  kromatografi yang menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan  ukuran yang berbeda. Teknik SEC pertama kali ditemukan oleh Grant Henry Lathe  dan Colin R. Ruthven. Teknik ini unik karena proses pemisahannya didasarkan pada ukuran molekul dari sampel. Molekul besar pada sampel akan dipisahkan dengan molekul yang kecil dalam sampel.

`Pada teknik ini, pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalam jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Akibatnya, molekul yang lebih besar terelusi dari kolom molekul cepat dan lebih kecil kemudian, yang secara efektif macam molekul berdasarkan ukuran. Ini adalah prinsip pemisahan kromatografi eksklusi ukuran .

                     Gambar A.1 Ilustrasi prinsip dasar kromatografi eksklusi

Fase diam yang digunakan dapat berupa silica atau polimer yang bersifat berpori (porus), sehingga solut dapat melewati porus tersebut (lewat diantara partikel), atau berdifusi melalui fase diam. Sedangkan fase gerak pada kromatografi ini tidak berpengaruh, sehingga pelarut yang berlainan yang mempunyai daya mensolvasi yang sama menghasilkan hasil yang sama. Sedikit banyak fase gerak pada kromatografi ekslusi ini serupa dengan gas pada kromatografi gas dalam hal fungsinya yang hanya sebagai medium netral yang memungkinkan molekul solut memasuki fase diam .

1.     Pemilihan Kolom

Pemilihan ukuran pori kemasan pada umumnya bergantung pada molekul solut yang akan dipisahkan. Sering sampel ukurannya sangat beragam (berat molekul berbeda-beda) dan dengan satu ukuran pori saja tidak memadai untuk memisahkan semua jenis molekul. Beberapa mungkin dieksklusi seluruhnya dari pori (K=0) dan terelusi sebagai satu puncak dengan volum mati (V0), sedangkan yang lain berpermeasi ke semua pori (K=1) dan terelusi sebagai satu puncak dengan volum permeasi total (V0 + Vp). Sedangkan molekul yang lainnya lagi berpermeasi ke pori secara selektif, bergantung pada ukuran relative dan terelusi dengan volum retensi (VR¬) yang dinyatakan oleh persamaan  ;

VR = V0 + KVp

Oleh karena itu, prinsip kromatografi eksklusi lainnya adalah terjadinya pemisahan molekul polimer sesuai dengan volume hidrodinamiknya ketika sampel diinjeksikan ke dalam  kolom.

Gambar A.2 Kolom Kromatografi Eksklusi Ukuran

Setiap kemasan ekslusi-ruang yang berbeda ukuran porinya mempunyai kurva kalibrasi sendiri. Batas eksklusi dan rentang kerja berat molekul pada gambar dibawah ini tidak didefinisikan secara tajam karena distribusi pori kemasan kolom tidak sempit. Distribusi pori pada kemasan menentukan kemiringan kurva kalibrasi. Jika distribusi pori besar, kurva mempunyai kemiringan yang tajam. Jadi, rentang kerja berat molekul besar, tetapi akan menghasilkan daya pisah rendah pada senyawa-senyawanya yang ukuran molekulnya hampir sama. Jika distribusinya sempit, kurva lebih mendatar, jadi rentang kerja berat molekul akan lebih kecil, tetapi daya pisah molekul yang ukurannya hampir sama akan meningkat

Gambar A3 (a) Kurva kalibrasi dan (b) kromatogramnya untuk kromatografi eksklusi

Kemasan untuk kromatografi eksklusi dapat dikelompokkan menjadi 3 golongan :

a.     Gel Setengah Kaku

Bahan ini biasanya berupa gel yang dipakai dalam pelarut organic, seperti aseton, tetrahidrofluran, dan sebagainya. Contoh dari golongan ini adalah gel TSK dan gel Styragel yang digunakan untuk memisahkan cuplikan polimer rumit, seperti karet dan plastic. Kekurangan utama kemasan partikel besar ini (dp = 35-75 mikrometer) adalah alih massanya yang rendah. Untuk memperoleh kemasan yang memadai, harus dipakai laju alir yang rendah, akan tetapi hal ini mengakibatkan waktu analisis yang panjang. Kemasan eksklusi partikel (dp = 10 mikrometer) telah dikembangkan, sehingga bisa mendorong alih massa yang cepat dan memungkinkan pemakaian laju alir yang tinggi, sehingga waktu analisis yang lebih pendek. Partikel kecil dengan pori berukuran kecil meghasilkan daya pisah tinggi, I ni berarti bahwa berat mokelul yang lebih rendah (1000-100) dapat dipisahkan.

b.     Gel Kemasan Kaku

Kemasan ini hampir selalu dibuat dari kaca atau silica. Keuntungan dari kemasan ini adalah kekuatannya menghilangkan pembatasan laju aliran karena dapat dipakai pada tekanan tinggi. Pelarut yang digunakan adalah air dan pelarut organic. Kekurangannya adalah adanya pengaruh absorban yang sering menyulitkan. Namun, harus diperhatikan bahwa larutan basa dengan pH > 7,5 harus dihindari, karena dapat melarutkan kaca dan silica. 

c.     Gel Lunak

Bahan kemasan ini contohnya adalah dekstran sambung silang dan sephadex. Kemasan gel lunak menggembung dalam pelarut air, gel ini berguna untuk memisahkan senyawa yang larut dalam air, yang rentang berat molekulnya 102 – 2,5.107. Fungsi utama dari gel lunak adalah untuk memisahkan polimer yang larut dalam air. Gel ini banyak dipakai dalam pencirian atau pengkarakterisasian protein dan enzim. Kekurangan bahan ini dapat diuraikan oleh bakteri yang dapat menyebabkan hilangnya kinerja kolom, gel lunak tidak dapat menahan tekanan > 150 psi dan sangat rapuh.

2.     Pemilihan Fase Gerak

Fasa gerak dipilih untuk meminimalisir interaksi solute dengan permukaan penyangga, memiliki kemurnian yang tinggi, tidak bereaksi dengan fase diam, tercampurkan dengan komponen system, pelarutnya baik untuk cuplikan, dapat membasahi permukaan kemasan dan viskositasnya rendah.

B. Teknik Permeasi atau Filtrasi Gel

            Teknik permeasi atau Filtrasi adalah suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasari atas inklusi dan eksklusi suatu zat terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang terikat silang ddan berpori heterogen. Dalam kromatografi eksklusi cair-padat pemisahan teradi antara vase cair di dalam partike gel dan cairan di luar mengelilingi partikel gel.
Sebagai penunjang fase diam dalam pemisahan ini biasanya digunakan xerogel-xerogel. Xerogel adalah suatu gel organik yang dapat bersifat hidrofilik (yaitu : agar dan dekstran yang terikat silang pada poliakrilamida) ataupun hidrofobik (poistirena). Xerogel-xerogel ini tersedia di pasaran dengan nama dagang biogel p-2 (poliakrilamida),sepadex G-10-200 (dekstran) juga styrogel (gel polistirena yang dimodifikasi) dan agarose. Kolom yang digunakan adalah kolom biaya pengelusi (luent) dibiarkan mengalir karena grafitasinya. Laju aliran akan bertambah dengan bertambahnya ukuran partikel seperti kromatografi pertukaran ion, laju aliran juga dapat dipengaruhi oleh variasi porositas gel. Untuk suatu gel yang tidak padat, volume interstisi dapat diturukan dengan pemberian tekanan, volume eluent berkisar antara 25 – 100 ml. sepertii juga metode kromatografi lainnya, konsekwensi efluaennya diukur melalui sifat-sifat fisik yang sesuai.. seperti indeks refraksi, absorbansi,, intensitaas pendar flour atau sifat-sifat listriknya.

 

Parameter-parameter kolom dapat dihubungkan secar matematik dengan
Vb = Vo + Vi + Vr = Vo Vs
Vi = m Sr/ Ps
Vi =Vo + Kd Vi

Dimana :
– Vi = volume bagiana dalam gel,
– Vr= volume matriks gel,
– Vs= volume total face diam gel,
– m = berat gel,
– Sr = volume pelarut yang dipakai,
– Ps = kerapatan pelarut,
– Kd = koefisien distribusi,
– Pr = kerapatan gel,
– Vb= volume bed,
– Vo= volume di luar gel,

 

Pemisahann suatu tipe gel bergantung pada ukurran molekul dan sifat kimia dari zat yang akan dipisahkan. Misalkan biogel 0 – 10 digunakan untuk zat-zat dengan berat molekul berkisar antara 500-17000 satuan. Molekul dengan besar molekul diatas batas ini yaitu limit eksklusif, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel. Di bawah limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai dengan volume bed total. Untuk bekerja dalam medium tidak berai, gel yang tepat digunakan adalah sephadex LH-20.
            Pemakain Kromatografi permeasi gel digunakan untuk analisis campran molekul dengan berat molkul yang berbeda seperti pemisahaan rafinosa, maltose, dengan menggunakan sephadex pada pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam ddan H2O sebagai eluent. Pemisahan molekul- molekul dengan berat molekul sama dapat juga dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe gel dan tinggi kolomnya. Pengeluaran garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang meliputi pembebasan garam dan senyawa berberat dengan molekul makro.

C. Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim Xilanase dari Bakteri Laut

Bacillus safencis strain LBF P20 Asal Pulau Pari Jakarta

1.     Pendahuluan

Xilanase merupakan enzim yang berperan dalam hidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi xilooligosakarida dan xilosa (Susilowati, 2012). Selain berperan dalam menghasilkan xilooliogosakarida, xilanase juga banyak dibutuhkan di berbagai bidang industri, misalnya industry kertas, farmasi, etanol, pakan ternak, makanan, dan minuman

Secara alami xilooligosakarida terdapat dalam buah-buahan, sayur-mayur, susu nabati, madu dan dapat diproduksi pada skala industri dari bahan hemiselulosa yang kaya xilan, dapat pula diperoleh dengan mengolah bahan limbah hasil hutan, pertanian atau limbah industri yang tinggi kandungan lignosellulosanya. Xilooligosakarida mempunyai nilai penting untuk digunakan sebagai bahan prebiotic. Enzim xilanase dihasilkan oleh berbagai jenis organisme seperti bakteri, khamir, kapang, protozoa, dan siput. Bakteri adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan. Produksi enzim dari bakteri memiliki keunggulan karena pertumbuhannya cepat, mudah ditumbuhkan, mudah diatur produksinya, dan mudah direkayasa secara genetika

Pemanfaatan bakteri laut memberikan peluang untuk mendapatkan enzim yang unik karena bakteri laut mempunyai karakter yang spesifik, yaitu dapat bertahan pada salinitas tinggi, suhu, cahaya, dan lingkungan ekstrim lainnya sehingga diharapkan bakteri laut dapat beradaptasi dan bertahan meski dilingkungan yang ekstrim

2.     METODE PENELITIAN

Mikroorganisme

Bakteri laut strain LBF P20 diperoleh dari koleksi Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Puslit Bioteknologi LIPI. Bakteri diremajakan dengan menginokulasi isolate dalam media padat ASW 3,8 %, ekstrak khamir 0,1 %, pepton 0,5 %, agar 1,8 %, birchwood xilan (sigma) 0,5 %.

Produksi Enzim Xilanase

Produksi enzim dilakukan pada media yang terdiri atas 3,8 % artificial sea water (ASW), 0,1 % ekstrak khamir, 0,5 % pepton, 0,5 % laktosa, 0,5 % urea. Erlenmeyer flasks 2L (2 Erlenmeyer) mengandung media kultur @ 400 mL disuplementasi dengan 1,5 % ampas tebu diinokulasikan dengan media prekulture 4 mL dan diinkubasikan selama 120 jam pada Bio-shaker BR-43FL, Taitec-Jepang dengan kecepatan 150 rpm selama 96 jam pada suhu 30 °C. Kultur dipanen dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm, suhu 4 °C selama 10 menit dan filtrat supernatan yang diperoleh diuji aktivitas xilanase dan kadar proteinnya.

Aktivitas Xilanase

Aktivitas enzim xilanase ditentukan dengan metode Bailey dkk (1992) dengan menggunakan xilan 0,5 % (w/v) dalam buffer fosfat 0,05 M (pH 7) selama 15 menit reaksi. Campuran reaksi terdiri atas 0,25 mL filtrat enzim dan substrat xilan 0,25 mL diinkubasi pada suhu 30 °C selama 15 menit dan reaksi dihentikan dengan penambahan DNS 500 µL (campuran reaksi akan berubah warna menjadi kuning orange) diikuti dengan pemanasan pada suhu 100 °C selama 10 menit. Jumlah gula reduksi yang terbentuk ditentukan dengan metode DNS (Miller, 1959) menggunakan standar xilosa (Sigma) dengan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 540 nm. Satu unit (U) aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol xilosa per menit dibawah kondisi reaksi. Substrat tanpa enzim digunakan sebagai kontrol reaksi.

Uji Kadar Protein

Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode folin phenol dengan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar (Lowry dkk., 1951). Kadar protein diukur denganAGRITECH, Vol. 37, No. 1, Februari 2017 32 menggunakan UV mini-1240, UV-VIS spektrofotometer (Shimadzu, Jepang) pada panjang gelombang 280 nm

 

Pemurnian Partial Xilanase

Enzim xilanase yang diproduksi dalam penelitian ini termasuk jenis enzim ekstraseluler. Tahap pertama pemurnian parsial adalah menghilangkan beberapa pengotor seperti karbohidrat dan memekatkan enzim ekstra kasar xylanase dengan menggunakan amicon®ultra-15 centrifugal filter devices (Merck Millipore). Sebanyak 10 mL ekstrak kasar enzim dimasukkan ke dalam falcon amicon (50 mL) dan disentrifuse (TOMY MX-307, high speed refrigerated micro centrifuge- Jepang) dengan kecepatan 4000 g pada suhu 4 °C. Bagian pengotor akan turun ke bagian bawah dan ekstrak kasar enzim akan terkonsentrat dibagian atas, sebanyak 1 mL. Ekstrak kasar enzim tersebut selanjutnya diuji kadar protein dan aktivitas enzimnya. Selanjutnya, pemurnian dilakukan menggunakan kromatografi filtrasi gel dan kromatografi penukar ion.

Pemurnian dengan filtrasi gel menggunakan matriks sephadex G-75 (Fase diam). Matriks dimasukkan secara perlahan kedalam kolom kromatografi. Volume xilanase yang dimurnikan sebanyak 0,5 mL. Sampel protein (Fase gerak) dialirkan kedalam kolom kemudian matriks sephadex G-75 (GE Healthcare) dielusi menggunakan buffer fosfat 0,02 M sehingga diperoleh beberapa fraksi dengan volume masing-masing fraksi sebanyak 1 mL dan diukur kadar protein dan aktivitas enzimnya untuk penentuan aktivitas enzim spesifik.

Pemurnian dengan kromatografi penukar anion dilakukan menggunakan AKTAPrimePlus (GE Healthcare) dengan metode ion exchange chromatography. Kolom yang digunakan yaitu kolom penukar anion Hi Trap Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). Fraksi yang ditampung sebanyak 1 mL/menit pada setiap tabung, dilanjutkan diukur kadar protein dan aktivitas enzimnya untuk penentuan aktivitas enzim spesifik

3.     KESIMPULAN

Produksi ekstrak enzim kasar xilanase yang dihasilkan oleh Bacillus safencis strain LBF P20 sebanyak 800 mL memiliki aktivitas enzim sebesar 6,278 U/mL. Aktivitas spesifik enzim dan tingkat kemurnian enzim xilanase meningkat seiring dengan tahapan pemurnian. Aktivitas spesifik enzim xilanase ekstrak kasar, pemekatan amicon ultra-15 centrifugal filter devices (Merck Millipore), kromatografi filtrasi gel dan kromatografi penukar anion berturut-turut sebesar 5,1 , 15,1, 34,7 dan 96,0 U/mg. Tingkat kemurnian enzim pada tahap akhir meningkat 18,8 kali lipat dari enzim ekstrak kasar dengan berat molekul berkisar 25 kDa. Enzim xilanase murni yang diperoleh memiliki kondisi reaksi optimum pada pH 7, suhu 60 °C dan stabil pada suhu dingin (4 °C). Jenis xilooligosakarida yang dihasilkan berupa xilobiosa, xilotriosa, dan xiloheksosa. 

A. KESIMPULAN

Dari penjelasan di atas dapat disimpulkan bahwa :
1. Kromatografi eksklusi adalah Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaann ukuran dan geometri molekul.
2. Kromatografi eksklusi dikelompokkan dalam tiga kategori diantaranya:
a. Teknik permeasi gel atau filtrasi gel,
b. Eksklus dan reterdasi ion
c. Inorganic molecular sieves
3. Teknik permeasi gel merupakan suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya.

 

 

 

Daftar Pustaka

Muthfi,Muhammad.Desember 2009.”Kromatografi Eksklusi”(online),

( https://banemo.wordpress.com,diakses pada 5 Mei 2021)

 Pakpahan, Charina. Juli 2017. Makalah kromatografi eksklusi.Palembang;

 Politeknik negeri sriwijaya